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技術交流

首頁 - 技術交流 - 牛血清常見問題

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血清的含義

血清,在血漿中除去纖維蛋白分離出的淡黃色透明液體或指纖維蛋白已被除去的血漿。其主要作用是提供基本營養物質、提供激素和各種生長因子、提供結合蛋白、提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷、對培養中的細胞起到某些保護作用。


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牛血清的主要成份

血清是一種很復雜的混合物,其組成成份雖大部分已為人所知,但還有一部分尚不清楚,而且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養條件不同而異。

 

1. 蛋白質是牛血清中主要成份之一。除包括可攜帶金屬離子、脂肪酸和自身是激素類蛋白外主要還有白蛋白,球蛋白,纖維粘連素(細胞促進細胞附著),α2巨球蛋白(抑制胰蛋白酶的作用);胎牛血清中含胎球蛋白(促細胞附著),轉鐵蛋白(能結合鐵離子,減少其毒性和被細胞利用)。

 

2. 多肽:血小板促生長因子能促細胞分裂,是多肽家庭的主要成員之一,是主要的促細胞增殖因子;成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子、神經細胞生長因子等,血清中含量雖很少,但對細胞生長也有一定作用。

 

3. 激素:激素對細胞的作用是多方面的。

胰島素:促進細胞攝取葡萄糖和氨基酸,與促細胞分裂有關。

類胰島素生長因子:能與細胞表達的胰島素受體結合,從而有胰島素同樣的作用。

促生長激素:促細胞增殖效應。

氫化可的松:血清中含有定量的該成分,它可能兼有促細胞貼附和增殖作用,但有人證明,血清中的氫化可的松,如細胞密度高時可能有抑制細胞的作用和誘導其發生分化。

 

4. 其他成份

氨基酸、葡萄糖、酮酸等對多種營養成分的合成培養基意義不大。與蛋白相結合狀態的微量元素對細胞培養有意義。


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牛血清的主要作用

1. 提供維持細胞指數生長必須的蛋白質、核酸、微量元素和多肽;

2. 維持細胞的膠體滲透壓;

3. 結合蛋白能與有毒金屬或熱原質結合,起到解毒作用;

4. 促進細胞在培養瓶上貼壁生長與擴增;

5. 平衡細胞培養液PH值的作用;

6. 抑制蛋白酶活性,從而保護細胞免受傷害。


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牛血清的用途

血清是一種純天然培養基,富含細胞生長繁殖的多種營養成分,諸如蛋白質、核酸和多肽等。并能保護細胞,使其免受損害。主要用于細胞培養、生物制品及診斷試劑的生產。


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優質牛血清的要求

應是純天然的、未加抗菌素和防腐劑:無菌、無支原體、無牛病毒、無噬菌體、低內毒素及良好的促細胞生長效應。


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生產優質牛血清的方法

1. 牛血清的來源:健康的不受感染的牛群及新生牛出生后及時采血,這是制備優質新牛血清的首要保證。

 

2. 采血要求:采血技術人員須經專業培訓:采血所需的工藝、設備能保障牛血不受外源性污染;嚴格無菌的采血操作規范;潔凈的采血環境,這是使采集的血液不受污染的必要保證。

 

3. 加工工藝與設備:符合GMP要求的潔凈車間;精密的過濾系統;獨特的制備工藝;嚴格的血清加工操作規范,這是生產優質牛血清的關鍵所在。

 

4. 質量檢驗:高等專業技術人員;先進的檢驗設備;完善的檢驗指標與檢測方法,這是確保優質牛血清質量的重要保證。

 

5. 產品監制:中國食品藥品鑒定研究院對本公司牛血清產品進行監制;定期按生產批數的一定比例進行抽檢,這是牛血清質量的最終保障。


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胎牛血清、新生牛血清、小牛血清有何區別

胎牛血清:指健康母牛正常分娩前采集胎牛血液加工而成的血清,其胎球蛋白較多,血清白蛋白含量高,而r-球蛋白含量極低甚至沒有,并富含多種生長因子,是培養細胞最優質的血清。

新生牛血清:指健康母牛正常分娩后不久采集加工而成的血清,其內含多種生長因子。

小牛血清:指出生后飼養一定時間(一周至六個月)再采集加工而成的血清,因與外界接觸時間過長,故血清內r-球蛋白含量較高,不利于細胞培養,特別是不利于病毒研究與疫苗生產。


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為何牛血清中會污染噬菌體,其危害表現在什么地方

噬菌體是感染細菌的病毒,牛血清中污染噬菌體,表明該牛血清曾受到細菌污染,而受細菌污染過的牛血清,不僅對固有的營養成分有所損害,更重要的是牛血清中會因細菌污染而含有許多毒素,對細胞生長不利。牛血清是否污染噬菌體是檢測牛血清在整個加工過程中有否受到外源性污染的一個重要指標。


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牛血清中污染支原體對細胞培養的危害

牛血清是細胞培養中最重要的原輔材料,牛血清若污染支原體會使培養的細胞受感染。導致細胞病變而死亡,使科研和生產工作無法繼續進行。


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牛血清中污染病毒對細胞培養的危害

牛血清中污染了病毒,若所培養的細胞對此病毒敏感,會使細胞發生病變、死亡,使后續工作無法進行。


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★選擇適合自己細胞培養的牛血清的最簡單方法

由于牛血清的批間差異和細胞種類不同,因此要找到一批適合自己用的牛血清的最簡單有效的方法是——用戶在購買牛血清前先試用樣品,通過篩選得到自己滿意的牛血清批號,然后把整個項目所需的牛血清一次買足,保持整個項目所需牛血清質量的一致性,這樣能夠確保項目如期順利完成。


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★如何保存牛血清

血清應保存在-10℃~-30℃。若您一次無法用完一瓶,建議您無菌分裝后再放回冷凍。


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★如何解凍血清才不會使其質量受損

我們建議您將血清從冷凍箱中取出后,先置于4℃冰箱中解凍或部分融化,然后再根據藥典范例“常溫”10~30℃下使之全部融化。

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★牛血清中蛋白質的析出,如何處理

牛血清經過凍融或滅活后有時會有少量纖維蛋白的析出,這是理化因素致血清中脂蛋白變性和纖粘連蛋白凝聚而形成沉淀。但這些絮狀沉淀物并不影響血清的質量。欲去除這些物質,可以將血清分裝至無菌離心管內,以1000轉/分~2000轉/分離心,這樣可以有效的去除沉淀物。


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★何謂熱滅活?有無必要

一般以56℃,30分鐘來處理已解凍的血清,該過程確保受熱均勻,因為此加熱步驟,可以使補體去活性,而補體所參與的反應有:溶細胞活性,平滑肌的收縮,肥大細胞和血小板組胺的釋放,增強吞噬作用,淋巴細胞、巨噬細胞的趨化和激活。

實驗顯示,經過正確處理的熱滅活血清,對大多數的細胞而言是不需要的。經過處理的血清對細胞生長只有微小的促進,或完全沒有任何作用,甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量,而造成細胞生長速率的降低。

而經過熱處理的血清,沉淀物的形成會顯著的增多,這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察,像是“小黑點”,常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染,而把血清放在37℃環境中,又會使此沉淀物更增多,使研究者認為是微生物的分裂擴增。

因此我們建議您,若非必須,您可以不需要做熱滅活這一步。如此以來,不但節省您寶貴的時間,更確保您血清的質量!


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如何避免沉淀物的產生

我們建議您在使用血清的時候,注意正確的解凍步驟,在滅活血清時,嚴格遵守對操作時間和溫度的要求。


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如何選用細胞培養基

在實驗工作中,選用適當的培養基,有利于工作的順利進行。首先要了解所要培養的細胞的特性,如細胞類型;細胞生長特點,是貼壁生長還是懸浮生長,以及其傳代時間等。其次,要注意培養基的血清濃度。選用的培養基建議與細胞采購信息一致,常用培養基有DMEM、MEM、1640等。


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★何時更換培養基/血清

1.視細胞生長密度而定,或遵照細胞建株的時間要求,按時更換培養基即可。另外,由于每一細胞株均有與其相適應的細胞培養基,不能驟然使用和原先提供的培養條件不同的培養基。這會影響細胞生長,實在無法供應的應半量替換,使細胞有一適應期。

2.更換不同批次血清前應做細胞適應性實驗,不能立即完全更換血清批號,防止細胞因不適應新批次血清而死亡,降低損失。

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能否使用與原來培養條件不同類別的血清

 不能使用與原來培養條件不同類別的血清

血清是培養細胞的一個極為重要的營養來源,所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清,其含有的細胞生長必須的營養成分不同,所以血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。


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培養細胞時應使用5%CO2還是10%CO2

一般培養基大都使用HCO3-/ CO3-/H+作為pH的緩沖系統,而培養基中 NaHCO3的含量將決定細胞培養時應使用的CO2濃度。當培養基中NaHCO3含量為每公升3.7克時,細胞培養時應使用10%CO2;當培養基中 NaHCO3含量為每公升1.5克時,則應使用5%CO2培養細胞。


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Hank’s平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培箱,其原因是什么?Hank’s平衡鹽溶液(HBS)和Eagle’s平衡鹽溶(EBS)在功能上有什么本質區別

HBS和EBS的主要差別在于碳酸氫鈉的水平上,在Eagle’s(2.2g/L)中比在 Hank’s(0.35g/L)中高。碳酸氫鈉需用高濃度的CO2平衡,以維持溶液的pH值。Eagles液在空氣水平的CO2中,溶液會變 堿,Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織,需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織,用 Hanks液就可以了。


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接種細胞密度以多少為宜

按照細胞株接種密度的基本數據或將細胞按比例稀釋成一定密度梯度后分瓶進行接種即可,一般以1ⅹ105個/ml為宜。細胞數太少或過度稀釋都不利于細胞生存和繁殖。這亦是造成細胞無法生長的主要原因之一。


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冷凍管應如何解凍

取出冷凍管后,必須立即放入37℃水浴中快速解凍,輕搖冷凍管使其在一分鐘內全部融化,并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發生污染情形。此外,冷凍管由液氮罐中取出解凍時,必須注意安全,以預防冷凍管爆裂。


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細胞冷凍管解凍培養時,是否應馬上去除DMSO

除少數特別注明對DMSO敏感的細胞外,絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞),在解凍之后,直接放入含有10%血清的新鮮培養基的瓶中即可。待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO,避免離心后損傷細胞。


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貼壁細胞傳代時所用胰酶的濃度為多少

一般使用的胰酶濃度為0.25%胰酶-0.53mMEDTA.4Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于–20 °C,避免反復冷凍解凍造成胰酶之活性降低,并可減少污染之機會。


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細胞冷凍培養基的組成

動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 % 原來細胞生長用之新鮮培養基式純血清均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能, 故不可將DMSO 直接加入細胞液中, 必須使用前先行配制完成。


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凍存用DMSO有何要求

冷凍保存使用之DMSO 等級,必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),其本身即為無菌狀況,第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于4°C,避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質,并可減少污染之機會。若要過濾DMSO, 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。


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冷凍保存細胞之方法

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ (-20℃ 30分鐘) → -60℃~-80℃ 16~18 小時(或隔夜) → 液氮中儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃以下, 再放入液氮中儲存。-20℃ 不超過1 小時, 以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-60℃~-80℃ 冰箱中,但存活率稍微降低一些。


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細胞冷凍保存時,細胞濃度應多少為宜

冷凍管內細胞數目一般為1~5x106cells/ml vial 為宜。


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培養基中是否須加抗生素

除特殊篩選外, 一般正常培養狀態下, 培養基中不應添加任何抗生素。


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應如何避免細胞污染

細胞污染的種類可分成細菌、真菌、病毒等。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、使用污染的血清和污染的細胞等。嚴格的無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好的細胞來源和培養基配制是減低污染之最好方法。


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如果細胞發生污染時,應如何處理

原則上:直接滅菌后將其丟棄。

當重要的細胞株被污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或其他,把污染細胞與其他細胞隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養皿和超凈臺,檢查HEPA過濾器。高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞株有毒性,因而,做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤為重要。

此外,也可將污染的細胞株注射到純系小鼠的腹腔,10天后回收細胞鏡鑒是否已消除污染。


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★為何培養基保存于4 ℃ 冰箱中,顏色會變,且pH值會越來越偏堿性

培養基保存于4℃冰箱中時,其內的CO2及其他物質 會逐漸溢出,造成培養基越來越偏堿性。而培養基中酸堿指示劑(通常為酚紅) 的顏色也會隨堿性增加而變化。培養基偏堿之結果,將造成細胞生長停滯或死亡。 建議控制培養液配置用量,不要長期存放,若培養基偏堿性時最好重新配制。


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引進的細胞存活率不佳可能因素

在細胞培養時出現存活率不佳, 常見原因可歸納為:于建株時培養條件不同(包括培養基和血清);細胞凍存、復蘇操作不規范;細胞建株已久,體外傳代過頻。建議細胞株適當擴增后應凍存保株,以免丟失。


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★在細胞培養過程中疑有運動的“小黑點”

在細胞培養過程中發現小黑點,習慣叫“黑膠蟲”,400倍顯微鏡下觀察到黑點呈半透明,分布在細胞間隙,上下翻滾運動,在細胞培養過程中有增多趨勢,但培養液不渾濁。若有此現象,建議進一步作無菌培養,批出外浮游生物污染,清潔凈化工作環境,規范無菌操作,消除污染源。


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★細胞培養中出現黑點是污染嗎?如何處理

一旦您在細胞培養的過程中發現有黑點生成,首先,要肉眼觀察培養基是否混濁,然后,在鏡下觀察培養細胞生長的狀態,黑點是否游動。如果細胞被污染,微生物則會大量繁殖,培養基就會迅速變黃、變混濁。污染包括細菌污染、支原體污染等。

如果在鏡下觀察細胞,生長狀態良好,與黑點出現前相比,沒有任何變化,那么,黑點的出現可能與以下幾種情況有關:

1.細胞生長過老,破碎的細胞殘骸;

2.血清析出物,可能與保存化凍有關;

3.配制培養基的pH值偏高,不宜細胞生長;

4.配制培養基的水質、容器不合格。可應用離心、過濾的方法去除這些黑點;

5.培養原代細胞中出現小黑點,可能是原代組織中的雜質,多次傳代可以消除。


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細胞培養中如何防止黑點生成

1. 盡可能地減少血清凍融次數。 

2. 培養基保持最佳PH值7.0- 7.2。 

3. 嚴格控制配制培養基的水質,容器按要求清潔后是否確認清潔有效及去污劑殘留。 

4. 掌握細胞傳代的最佳時機,細胞切勿生長過老。


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